Leta 1848 je skupina štirih misijonarjev po dolgem potovanju po Nilu in prečkanju puščave v izogib brzicam na reki le prispela v Kartum. Vsi so bili zelo izčrpani in Ryllo je po okužbi z mrzlico na hitro umrl, pred tem pa vsa pooblastila prenesel na Knobleharja. Po hitri vzpostavitvi razmer za delovanje osrednje misijonske postaje v Kartumu, se je Knoblehar že naslednjega leta odpravil na pot proti ekvatorju.
Cilji njegovega misijonskega delovanja v Sudanu so bili: spreobrnjenje domačinov, pastoralna skrb zanje in prizadevanje za odpravo suženjstva. Njegov boj proti trgovanju s sužnji je veliko prispeval k dokončni prepovedi te dejavnosti.
Knoblehar je med letoma 1849 in 1857 deloval predvsem na območju Belega Nila v južnem Sudanu. Poleg misijonskega centra v Kartumu je s sodelavci v vasi Gondokoro, na ozemlju ljudstva Bari, zgradil prvo misijonsko postajo. Kasneje so med ljudstvom Kik ustanovili še manjšo misijonsko postajo Sv. Križ, ki je ime dobila po koščku lesa iz križa, na katerem je bil križan Jezus Kristus. Dragocena relikvija je bila dar lavantinskega knezoškofa Antona Martina Slomška. Prva postaja je bila v bližini današnjega kraja Bor, druga pa blizu mesta Juba, ki je od leta 2011 prestolnica nove afriške države, Republike Južni Sudan.
S prvim potovanjem po Nilu na jug (konec 1849 in v začetku 1850), je Knoblehar pridobil dragocene informacije o deželi in vedenje, da lahko veliki afriški misijonski načrt uresniči le ob veliki finančni podpori. Po vrnitvi v Kartum je hitro odpotoval v Evropo s ciljem organizirati redno financiranje misijonskega dela in poiskati več novih sodelavcev. Zadane cilje je več kot uspešno dosegel, saj je nad svojim delom navdušil mladega cesarja Franca Jožefa I., ki mu je obljubil osebno pokroviteljstvo nad misijonom in ustrezno gmotno podporo, v Rimu pa je enourno avdienco pri papežu Piju IX. zapustil z listino o imenovanju za provikarja in s papeževim darilom, kelihom in monštranco. Ustavil se je tudi v domačih krajih, kjer se je sredi poletja 1850 sprehajal oblečen v značilno orientalsko nošo, v dolgi halji in s svilenim šalom okrog glave. Kot tak je po Ljubljani in drugih slovenskih krajih zbujal veliko pozornosti, prav tako kot afriška zbirka, ki jo je predstavil v ljubljanskem liceju. Razstavljenih je bilo preko tristo predmetov, ljubljanski časopis Laibacher Zeitung je objavil celoten popis zbirke.
Po njegovi zaslugi so se Slovenci prvič srečali s kulturno dediščino različnih ljudstev ob Belem Nilu. Knobleharjeve javne nastope in mašne slovesnosti je pospremila še izdaja nemške in slovenske knjižice z naslovom »Potovanje po Beli Reki«, ki jo je na podlagi Knobleharjevih zapiskov pripravil profesor zemljepisa in zgodovine Vincencij Fereri Klun.
